对话阿斯利康：如何开发用于干细胞工程的单克隆细胞株？
不可否认，细胞株构建开发中单克隆性的保证是至关重要的，而这些细胞株可用来生产治疗药物（例如单克隆抗体或基于细胞的治疗方法）。如果没有明确的方法来追踪单细胞的克隆生长，那么简单地观察板孔中的克隆或使用单克隆性的置信水平，并不能构成单克隆性的充分证据。
我们最近与阿斯利康生物制药发展部的科学家Gargi Roy讨论了当前改进干细胞株工程的挑战和机遇。此前，Roy和她的研究团队使用ClonePix FL从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产治疗性单克隆抗体[1]。当他们将重点转移到干细胞工程时，很明显尽管有单抗生产的共同点，但这两种工作流程存在差异。阿斯利康的干细胞治疗团队一直在进行干细胞工程和单克隆开发，此外，Roy详细介绍了她的团队如何以更高的准确度培养单克隆细胞株。
1.干细胞工程
干细胞工程涉及将体细胞(除精子和卵细胞之外的任何生物细胞)或胚胎细胞转化为能够分化为所有细胞类型的干细胞。这种方法旨在开发各种细胞模型，用于疾病建模、个性化医疗、药物发现和基于干细胞的治疗，如单克隆抗体。
两种主要的干细胞工程方法如下:
1）诱导多能干细胞(iPSCs)：通过引入转录因子由体细胞转化而来。
2）胚胎干细胞(ESCs)：来源于未分化的胚胎内细胞团。
这两种类型的干细胞共同点是可以利用它们产生单克隆抗体。此外，干细胞介导的单克隆抗体较重组单克隆抗体具有某些优势，例如会更好地渗透到病变区域和较高的血脑屏障(BBB)穿越率。[2].
2.如何生产单克隆细胞株:工作流程
无论您使用iPSCs、ESC或其他细胞类型，下面总结的基础工作流程适用于单克隆细胞株生产：
1）单细胞分离：分离一个单细胞，开始克隆；
2）细胞扩增和鉴定：形成克隆并评估单克隆性，通过运行基因型/表型分析确保您的细胞表达目的蛋白；
3）克隆细胞株：细胞类型特异性分化。
3.单细胞分离和克隆生长面临的挑战
即使有更好的单细胞分离技术和单克隆工作流程，仍然有可能遇到一些挑战。Gargi Roy团队想要在多个板子上分离细胞并形成具有相同特征的多个克隆时，主要的挑战就出现了。随着单细胞分离板数的增加，人们经常观察到克隆生长效率的稳定下降。在ACF（animal component-free）条件时下降幅度更大，您需要考虑ACF的研究对您所在机构是否至关重要。
与iPSCs相比，ESCs中克隆生长效率的差异更为突出，使用改造过的ESCs效率下降到了个位数。Roy指出下降的主要原因是铺板过程中细胞存活率的下降，她还强调通过富集培养基来改善实验设计，尤其是在ACF条件下。
iPSCs和ESCs之间单细胞克隆生长效率
的差异说明了ESCs的显著差异
即使有足够的克隆生长，也必须非常注意防止细胞凋亡，8-10天的适时收取至关重要。细胞的聚集是阻碍单克隆性评估的另一个问题，您必须使用正确的解离试剂将细胞从孔表面彼此分离，这是下游分析的关键步骤。
4.单克隆细胞株开发过程中的困难
单克隆性验证对细胞株的开发至关重要，您需要提供细胞群来源于单细胞的详细证据以供监管备案。Roy的团队发现ESCs由于其粘性表面和不规则形状而特别难以监控，如果两个ESCs非常接近，则很可能将它们判定为单细胞。此外，如果您的时间很紧张，您可以对统计数据应用有限稀释法来计算单克隆性的可能性。
CloneSelect单细胞分离系统和CSI细胞生长分析系统的联用不仅可在单细胞分离时证明单克隆性，并能在细胞沉积过程中轻松区分两个非常接近的细胞，还允许您追溯从收获当天到第0天的克隆以确保单克隆性，如下图所示。
使用CloneSelect单细胞分离系统和CSI细胞生长分析系统
确认单克隆性并捕捉单细胞图像
5.克隆鉴定
细胞株开发的最后一部分是表征，一旦评估了单克隆性，您要确保这种单克隆性体现在基因型和多能性中，克隆中的细胞是否都具有一致的所需功能水平？更重要的是，它们在遗传上是否稳定，也就是说它们可以保存遗传物质并将其传至下一代？最后，它们是否具有多能性(即能否分化为三个主要胚层-外胚层、内胚层和中胚层)？只有通过高通量克隆筛选才能得到答案。
CSI细胞生长分析系统包含无标签明场技术，可定制荧光成像，并配有高级数据分析工具，包括汇合度测定、生长曲线、单克隆性报告生成和板缩略图，以快速可视化每孔的克隆生长。凭借高分辨率和多种成像模式，您甚至可以检测克隆中细胞特有的细胞标记物，这使您可以确认您的单克隆细胞株是否具有所需的功能
下图显示了单克隆ESCs分化为三个不同的胚层，每个胚层中带有各自的生物标记。
单细胞分离系统是iPSCs和ESCs单细胞分离的有效工具。CloneSelect细胞生长分析系统和单细胞分离系统的组合提供了基于图像的单克隆性保证证明。
——Gargi Roy，生物制药开发的细胞培养和发酵科学博士，阿斯利康
CloneSelect细胞生长分析系统的功能评估范围将持续到开始细胞分化阶段之后，通过荧光成像，您可以监测细胞分化形成不同组织层的过程。
6.如何了解更多关于单克隆细胞株的信息？
从最初的铺板阶段到生长和细胞分化，使用我们的克隆选择工作流程进行单克隆确认，单克隆细胞株的开发更简单。您可以进一步了解阿斯利康干细胞团队的研究，以获得更多关于CloneSelect细胞生长分析系统和单细胞分离系统保证工作流程的信息。目前最新的Webinar（Monoclonality Assurance Using CloneSelect Single-Cell Printer and CloneSelect Imager in Human Stem Cell(hSC)Engineering Workflow,with Dr.Roy）中，Gargi Roy阐述了如何构建单克隆细胞株和评估克隆细胞研究中单克隆性的挑战和解决方案的许多细节。
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